G-四鏈體是由一段或幾段富G序列通過分子內(nèi)或分子間Hoogsteen氫鍵連接成具有四股核苷酸鏈的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，特定的陽離子（K+、Na+、NH4+等）位于結(jié)構(gòu)中心進(jìn)一步穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。相對(duì)于雙鏈DNA來說，G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有離子依賴性，并根據(jù)富G序列的不同特點(diǎn)呈現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)形態(tài)，因此為許多生物有機(jī)小分子提供不同的識(shí)別位點(diǎn)。這些小分子配體不僅可以識(shí)別特定構(gòu)型的G-四鏈體，形成復(fù)合物結(jié)構(gòu)后還能顯示出特別的生物活性。其中，G-四鏈體與高鐵血紅素（hemin）形成的復(fù)合物顯示出過氧化物酶催化活性，因此被稱為G-四鏈體/hemin脫氧核酶（G4/hemin DNAzyme），又叫G-四鏈體過氧化物酶。目前，作為一種人工酶或催化劑，G-四鏈體過氧化物酶被應(yīng)用在生物分析、分子機(jī)器和DNA傳感器等多個(gè)領(lǐng)域。相較于傳統(tǒng)的催化酶，它具有低成本、易操作和高穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，這使得探究其催化的內(nèi)在機(jī)理、提升催化活性的研究變得愈加重要。然而，已有研究?jī)H給出一些經(jīng)驗(yàn)式結(jié)論，如hemin更傾向于與平行或混雜型的G-四鏈體結(jié)合，hemin主要與平行G-四鏈體的3′末端的G-平面作用等。

　　為探究G-四鏈體過氧化物酶催化的內(nèi)在機(jī)理、一般規(guī)律以及建立高效的催化體系，中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所研究員裴仁軍課題組展開系列工作。項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)研究在d（G3TG3TG3TG3）序列（簡(jiǎn)寫為TTT，它主要形成分子內(nèi)平行G-四鏈體）的不同位置處引入極性轉(zhuǎn)折位點(diǎn)，即設(shè)計(jì)3′G5′-5′GGTG3TG3TG3-3′（G55TTT）、3′G3TG35′-5′TG3TG3-3′（TG55TT）、5′G3TG3TG3TGG3′-3′G5′（TTTG33）和5′G3TG3T3′-3′G3TG3-5′（TTG33T）四條序列，探究不同序列修飾對(duì)于結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以上修飾不會(huì)改變結(jié)構(gòu)的平行構(gòu)型，然而不同極性轉(zhuǎn)折位點(diǎn)的引入對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)末端堆積具有重要影響：如當(dāng)序列中末端一個(gè)G堿基發(fā)生轉(zhuǎn)置時(shí)，G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和分子間末端堆積相應(yīng)增強(qiáng)，因此修飾后富G序列形成的G-四鏈體與卟啉分子（如NMM和hemin）的相互作用增強(qiáng)，有利于提升G-四鏈體過氧化物酶的催化活性；相反，如果在序列的中間位置（靠近中間T堿基處）引入轉(zhuǎn)折位點(diǎn)，G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和分子間末端堆積相應(yīng)減弱，不利于四鏈DNA結(jié)構(gòu)與hemin的結(jié)合（圖1）。該研究發(fā)表在Wiley旗下雜志Chemistry-A European Journal上。

　　項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)選取較短的d（AGGGGA）序列為初始研究對(duì)象，該序列主要形成四分子平行G-四鏈體，末端的A堿基作為酸堿催化劑有利于進(jìn)一步提升體系的催化活性。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)d（AGGGGA）序列中的G堿基的8號(hào)位點(diǎn)進(jìn)行選擇性溴代修飾，改變鳥嘌呤核苷的順反異構(gòu)，獲得不同構(gòu)型的末端G-平面。設(shè)計(jì)d（AGBrGBrGGA)（F12）、d（AGBrGGGBrA）（F14）和d（AGBrGGBrGA）（F13）三條序列，形成四鏈結(jié)構(gòu)（圖2A-2D）。圖2E-2F顯示，它們與卟啉分子NMM和hemin結(jié)合后熒光性能和催化活性大小順序?yàn)椋篈G4A ≈F12>F14>F13。hemin親和力測(cè)試實(shí)驗(yàn)與上述結(jié)果保持一致，由此可以得出平行G-四鏈體催化活性大于反平行G-四鏈體主要是由于結(jié)構(gòu)中含有3′-末端G-平面，且末端G-平面中反式的鳥嘌呤核苷更有利于與hemin結(jié)合發(fā)揮催化性能。

　　在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)d（AGGGGA）序列進(jìn)一步修飾——在序列的不同位置處引入極性轉(zhuǎn)折位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3'AG5'-5'GGGA3'（AGS55）、3'AGG5'-5'GGA3'（AG55）、5'A3'-3'GG5'-5'GG3'-3'A5'（A33G55）、3'A5'-5'GG3'-3'GG5'-5'A3'（A55G33）和5'AGG3'-3'GGA5'（AG33）五條序列，形成四鏈結(jié)構(gòu)（圖3）。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，它們的催化活性大小順序?yàn)椋篈G55>AGS55>A33G55>A55G33>AG4A>>AG33（圖4）。結(jié)合hemin親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，增加3′-末端G-平面和3′A堿基的個(gè)數(shù)均可以提升G-四鏈體過氧化物酶的催化活性。該研究成果發(fā)表在Royal Society of Chemistry旗下雜志Chemical Science上。

　　研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出具有酸性依賴性的G-四鏈體過氧化物酶。目前報(bào)道的大部分G-四鏈體過氧化物酶都顯示在pH為弱堿性的溶液條件下呈現(xiàn)較好的催化活性，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)G-四鏈體序列中含有多個(gè)末端A堿基時(shí)，在ABTS-H2O2體系下，弱酸性溶液中的催化活性較好。為進(jìn)一步設(shè)計(jì)出具有酸性依賴性的G-四鏈體過氧化物酶，該團(tuán)隊(duì)在d（AG4A）序列的3'末端引入-CCCCCCC（-C7）片段，即d（AG4AC7），該序列在特定的酸性溶液中可以組裝為“G-四鏈體+I-motif”交替連接的超分子DNA結(jié)構(gòu)，在中性或堿性溶液中則主要以單鏈或不完全互補(bǔ)的雙鏈形式存在。因此，d（AG4AC7）當(dāng)且僅當(dāng)體系在弱酸條件下（pH 4.5-6.0）顯示出較強(qiáng)的催化活性。相同原理，d（AGBrGGBrGAC7）（F13C7）、3'AG5'-5'GGGACCCCCCC3'（AGS55C7）兩條序列與hemin形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示出類似的特性。3'AGG5'-5'GGACCCCCCC3'（AG55C7）序列中，3'AGG5'-5'GGA3'片段形成的四分子G-四鏈體具有非常強(qiáng)的熱穩(wěn)定性（Tm>95℃），因此AG55C7在酸性條件下組裝超分子結(jié)構(gòu)，在非酸性條件下以四分子G-四鏈體單體形式存在，使該序列的催化活性受pH影響有限（圖5）。該研究成果發(fā)表在Royal Society of Chemistry旗下雜志Chemical Communications（DOI：10.1039/D0CC03082A）上。

　　裴仁軍課題組博士后曹艷偉為論文第一作者，裴仁軍為通訊作者，相關(guān)工作得到國家自然科學(xué)基金青年基金、江蘇省自然科學(xué)基金青年基金、中國博士后科學(xué)基金會(huì)資助以及中國博士后科學(xué)基金會(huì)面上項(xiàng)目的支持。

圖1.（A）G-四鏈體過氧化物酶在ABTS-H2O2體系下的催化流程圖；（B-C）上述序列與NMM和hemin結(jié)合后熒光性能和催化活性對(duì)比

圖2.（A-D）AG4A、F12、F14和F13形成的四分子G-四鏈體；（E-F）四條序列與NMM和hemin結(jié)合后熒光性能和催化活性對(duì)比

圖3.（A-E）AG55、AGS55、A33G55、A55G33和AG33形成的四分子G-四鏈體

圖4.（A）AGS55、AG55、A33G55、A55G33和AG33在pH 5 KCl中的圓二譜圖；（B）1.8μM NMM分別滴定2.4μM AGS55、AG55、A33G55、A55G33和AG33；（C）AG4A、AGS55、AG55、A33G55、A55G33和AG33在KCl和NaCl（pH 5）的V0值統(tǒng)計(jì)；（D）不同序列V0值隨溶液pH的變化曲線

圖5.（A）AG4AC7、F13C7、AGS55C7和AG55C7形成DNA超分子結(jié)構(gòu)的單體及其組裝示意圖；（B）AG4AC7和AGS55C7組裝結(jié)構(gòu)的pH可控性；（C）AG4AC7、F13C7、AGS55C7和AG55C7序列V0值隨溶液pH的變化曲線