??一、研究背景

生、老、病、死是人類不可避免的問題，我們從生下來以后，就逐漸走向死亡，會(huì)慢慢衰老，會(huì)生病。生物技術(shù)在治療人類疾病及衰老方面起著至關(guān)重要的作用。生物制造的目標(biāo)是設(shè)計(jì)組織支架來治療選擇有限的疾病，如晚期器官衰竭。3D生物打印已經(jīng)在微生理器件，模式化組織，可灌注的血管網(wǎng)絡(luò)和可植入支架等方面取得了重要的里程碑。然而，直接打印活細(xì)胞和軟物質(zhì)生物材料，如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白已經(jīng)被證明是困難的。一個(gè)關(guān)鍵性的障礙是如何在打印過程中支持這些柔軟和動(dòng)態(tài)的生物材料，以達(dá)到重建復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)和功能所需的分辨率和保真度。

最近，Dvir和他的同事將一種脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠打印到一個(gè)類似心臟的模型中，結(jié)果表明，人類心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞可以整合到打印中，并在培養(yǎng)1天后以球形中立細(xì)胞的形式出現(xiàn)。然而，他們沒有進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)或功能分析。

膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此它是一種理想的生物制造材料。在細(xì)胞外基質(zhì)中，膠原蛋白提供了機(jī)械強(qiáng)度，使細(xì)胞和組織間的結(jié)構(gòu)組織得以分開，并作為細(xì)胞粘附和信號(hào)分子的倉庫。然而，由于膠原蛋白的凝膠化通常是通過熱驅(qū)動(dòng)的自組裝來實(shí)現(xiàn)的，很難控制，因此很難用天然未改性的膠原蛋白來構(gòu)建3D生物打印的復(fù)合支架。研究人員已經(jīng)使用了一些方法來改性膠原蛋白制備水凝膠，包括用化學(xué)方法將膠原蛋白改性成紫外可交聯(lián)的，以及通過調(diào)整pH值、溫度和膠原蛋白濃度來控制凝膠化和打印保真度，或?qū)⑵渥冃猿赡z以使其具有熱致可逆性。然而，這些水凝膠通常是柔軟的，容易下垂，因此它們很難打印出超過幾層高度的高保真度。

二、研究成果

膠原蛋白是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。使用膠原蛋白支架來制備具有復(fù)制組織、器官的結(jié)構(gòu)和功能已被證明是一個(gè)挑戰(zhàn)性的問題。美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)Feinberg教授團(tuán)隊(duì)提出了一種利用自由的可逆嵌入懸浮水凝膠(FRESH)來對膠原蛋白進(jìn)行3D生物打印，這種方法能夠在不同的尺度上直接獲得具有精確控制組成和微觀結(jié)構(gòu)的人心臟組織成分，從毛細(xì)血管到整個(gè)器官。通過控制pH驅(qū)動(dòng)的凝膠不僅可以提供20微米的細(xì)絲分辨率，而且還可以獲得能夠快速細(xì)胞滲透和微血管化的多孔結(jié)構(gòu)，以及提供用于制造和灌注多尺度血管系統(tǒng)和三葉瓣膜的機(jī)械強(qiáng)度。作者發(fā)現(xiàn)通過微型電腦斷層掃描技術(shù)可以證明3D生物打印的FRESH心臟可以精確地復(fù)制患者特有的解剖結(jié)構(gòu)。此外，用人類心肌細(xì)胞打印的心室顯示同步收縮，定向動(dòng)作電位傳播，以及在收縮高峰期壁增厚高達(dá)14%。該工作發(fā)表在《Science》上。

三、圖文速遞

圖1. 使用FRESH v2.0水凝膠對膠原蛋白進(jìn)行高分辨率的3D生物打印。

(A) 3D打印字母的延時(shí)序列。(B) 將酸化的膠原蛋白溶液擠出到pH 7.4的FRESH支撐液中，快速中和使膠原蛋白凝膠化，形成膠原蛋白絲。(C) FRESH v1.0和(D) FRESH v2.0支撐液中明膠微粒的代表性圖像，顯示尺寸和多分散性下降。(E) FRESH v1.0 (藍(lán)色)和FRESH v2.0 (紅色)中明膠微粒的直徑分布直方圖。(F) FRESH v1.0和FRESH v2.0中明膠微粒平均直徑[N > 1200]。(G) 在FRESH v1.0和FRESH v2.0支撐液中，存儲(chǔ)模量(G?)和損耗模量(G?)顯示屈服應(yīng)力流體行為。(H) 中間具有單纖維的“窗口框架”的打印結(jié)構(gòu)，分別來自于G-編碼(左)、FRESH v1.0(中)和FRESH v2.0(右)。(I)使用FRESH v1.0打印單絲膠原蛋白(頂部)，以及 FRESH v2.0打印直徑為20 - 200mm的相對光滑的絲狀膠原蛋白(底部)。(J) FRESH v2.0獲得的膠原纖維直徑作為擠出針內(nèi)徑為的函數(shù)，呈線性關(guān)系。

圖2. FRESH的3D生物打印構(gòu)建可灌注的膠原血管和微孔膠原蛋白支架，可促進(jìn)體內(nèi)微血管的形成。

(A) FRESH打印的膠原蛋白管結(jié)構(gòu)。(B) 將C2C12細(xì)胞與膠原凝膠混合物在膠原蛋白管周圍鑄型，靜置培養(yǎng)5天。(C) 來自于(B)的活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色)的組織橫切面。(D)將C2C12細(xì)胞與膠原凝膠混合物在膠原蛋白管周圍鑄型，灌注5天。(E) 來自于(D)的活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色)的組織橫切面。(F) 細(xì)胞存活率作為組織表層深度的函數(shù)。(G)從支撐液中移除明膠微粒后，多光子成像顯示FRESH打印的膠原結(jié)構(gòu)中的微尺度孔隙。(H和I) 皮下植入7天后，膠原蛋白構(gòu)建無VEGF的模型(H)和FRESH打印(I)。(J和K) 馬森三色染色觀察細(xì)胞(紅色)和膠原蛋白(藍(lán)色)。(L) 植入后細(xì)胞密度作為鑄型和FRESH打印的膠原盤深度的函數(shù)。(M和N) 皮下植入10天后，用VEGF (100 ng/ml)處理構(gòu)建膠原模型(M)和FRESH打印(N)。(O和P) 皮下植入10天后，注入VEGF (100ng /ml)的鑄型(O)和FRESH打印(P)的膠原盤CD31染色(棕色)和細(xì)胞(藍(lán)色)。(Q)凝集素尾靜脈注射標(biāo)記的FRESH打印膠原盤內(nèi)宿主血管浸潤(直徑8 ~ 50mm)(紅色)。(R)進(jìn)入FRESH打印的結(jié)構(gòu)70毫米的多光子圖像，顯示微血管系統(tǒng)腔內(nèi)的紅細(xì)胞。

圖3. 可收縮的FRESH 3D生物打印的人心室模型。

(A) 使用膠原蛋白墨水和高濃度細(xì)胞墨水進(jìn)行雙材料FRESH打印的示意圖。(B) 心室模型，心肌細(xì)胞的中心部分 (粉紅色)，內(nèi)外膠原蛋白殼(綠色)，僅含膠原蛋白的切片(黃色)。(C) FRESH打印的心室顯微圖。(D) 鈣敏感染料染色的FRESH打印的心室側(cè)視圖，顯示細(xì)胞分布均勻。(E) 子區(qū)域的鈣圖譜[(D)中的黃色框]，顯示自發(fā)的、定向的鈣波傳播，傳導(dǎo)速度為1.97 cm/s。(F) 用鈣敏感染料染色的FRESH打印的心室俯視圖。(G) 鈣譜顯示自發(fā)圓鈣波在心室周圍傳播，傳導(dǎo)速度為1.31 cm/s。(H) 用鈣敏染料染色的FRESH打印的心室穴位刺激(紅色星號(hào)表示電極位置)。(I) 子區(qū)域[(H)中的黃色框]的鈣映射，顯示了縱向傳導(dǎo)速度為2.0 cm/s的各向異性鈣波傳播。(J) 自發(fā)收縮時(shí)的鈣瞬態(tài)軌跡(上)、1-Hz場刺激(中)和2-Hz場刺激(下)。鈣熒光強(qiáng)度(F)通過除以基線熒光強(qiáng)度(F0)歸一化。(K) FRESH打印的心室自上而下的圖像，內(nèi)室(黃色)和外室(紅色)的輪廓。(L) 分析1-Hz場刺激時(shí)心室壁的一個(gè)分區(qū)的位移，顯示室內(nèi)外壁的運(yùn)動(dòng);大小和方向用紅色箭頭表示。(M) 在收縮期峰值時(shí)心室內(nèi)室橫截面積(N = 4)。

圖4. 器官規(guī)模的FRESH 3D生物打印的三葉心臟瓣膜和多尺度血管系統(tǒng)，以及新生兒規(guī)模的心臟。

(A) 成人規(guī)模的三葉心臟瓣膜的三維模型。(B和C) FRESH 3D打印的膠原心瓣膜頂部和側(cè)面圖，添加硫酸鋇作x線對比。(D) uCT重建顯示全打印閥門。(E) 側(cè)壁和單張的橫截面。(F) 對uCT三維表面與三維模型進(jìn)行定量測量，平均上印量為+0.55 mm，下印量為-0.80 mm。(G) 脈動(dòng)流量超過1秒時(shí)閥門開啟順序。(H) 一個(gè)單循環(huán)內(nèi)的多普勒血流速度測量: (i)關(guān)閉、(ii)半開和(iii)打開。(I) 與(H)在多個(gè)周期內(nèi)相同。(J) 與天然閥門工作壓力相比，打印好的藻酸鹽和膠原蛋白閥門的最大跨瓣壓力[N = 3]。(K) 通過計(jì)算得到的具有左心室多尺度血管網(wǎng)絡(luò)的MRI衍生的 3D人類的心臟模型(灰色)。左冠狀動(dòng)脈前降支(紅色)是引導(dǎo)小尺度血管形成的模板，小尺度血管的直徑隨著離冠狀動(dòng)脈(紅色到藍(lán)色)的距離而減小。(L) 左心室的冠狀動(dòng)脈前降支(紅色)，計(jì)算生成的脈管系統(tǒng)(紫色)和感興趣的子區(qū)域(粉紅色)。(M) 透明區(qū)顯示血管網(wǎng)絡(luò)三維結(jié)構(gòu)。(N) FRESH生物打印的膠原蛋白子區(qū)域，顯示血管網(wǎng)絡(luò)的再生。(O) 相互連接的經(jīng)過冠狀動(dòng)脈使用甘油灌注血管網(wǎng)絡(luò)(紅色)。(P) 膠原蛋白經(jīng)光學(xué)清除并灌注甘油(紅色)，顯示灌注至直徑約100 mm的血管。(Q) 按新生兒大小縮放的MRI衍生的3D人類心臟。(R) FRESH打印的膠原蛋白心臟。(S) 膠原蛋白心臟橫切面，顯示左右心室和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。(T和U) 左心室骨小梁的高保真圖像(T)，顯示從G-編碼復(fù)制的復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)(U)。(V和W)心室之間隔膜的高保真圖像(V)，顯示了從G-編碼復(fù)制的方格子填充(W)。

四、研究小結(jié)

這種3D生物打印技術(shù)使用快速的pH值變化來驅(qū)動(dòng)膠原蛋白在緩沖支撐材料中進(jìn)行自組裝，使得能夠：(1)使用未經(jīng)化學(xué)修飾的膠原蛋白作為生物墨水，(2)使用12至24 mg/ml的高膠原蛋白濃度來增強(qiáng)機(jī)械性能，(3)創(chuàng)建復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和功能。雖然只用了人類的心臟來證明這個(gè)概念，但是FRESH的3D生物打印技術(shù)是打印膠原蛋白是一個(gè)平臺(tái)，可以發(fā)展成適用于多種器官體系的先進(jìn)組織支架。在這個(gè)過程中，仍有許多挑戰(zhàn)需要克服，如產(chǎn)生組織所需的數(shù)十億細(xì)胞需要對大型組織進(jìn)行3D生物打印，實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，以及為臨床應(yīng)用建立一個(gè)監(jiān)管機(jī)制。雖然一個(gè)功能齊全的器官的3D生物打印尚未實(shí)現(xiàn)，但我們現(xiàn)在有能力去開始構(gòu)建原生組織的結(jié)構(gòu)、機(jī)械和生物學(xué)特性。

五、參考文獻(xiàn)信息及鏈接

A. Lee*, A. R.Hudson*, D. J. Shiwarski1, J. W. Tashman, T. J. Hinton, S. Yerneni, J. M.Bliley, P. G. Campbell, A. W. Feinberg, 3D bioprinting of collagen to rebuild componentsof the human heart, Science, 2019, 365, 482–487. DIO: 10.1126/science.aav9051.

https://science.sciencemag.org/content/365/6452/482