顆粒在線訊：肝膽癌，包括肝細(xì)胞癌（HCC）是全球范圍內(nèi)的高致死性癌癥。大多數(shù)HCC患者在確診時(shí)已經(jīng)處于疾病的晚期。而在肝癌發(fā)生的早期階段，如果及時(shí)發(fā)現(xiàn)仍有治愈性治療方法，但現(xiàn)在對(duì)HCC結(jié)節(jié)進(jìn)行準(zhǔn)確診斷的需求尚未得到滿足。與大多數(shù)癌癥在治療前需要確認(rèn)活檢不同，磁共振成像（MRI）是無創(chuàng)的，已被臨床推薦用于建立HCC的診斷和分期，其中造影劑（CA）被用來選擇性地調(diào)節(jié)（磁共振）MR信號(hào)，以提高腫瘤的可見度。因此，早期肝癌的體內(nèi)磁共振檢測(cè)特別依賴于敏感和特異的CAs，以安全地觀察復(fù)雜的肝臟系統(tǒng)中細(xì)微的分子改變。盡管在設(shè)計(jì)和合成肝細(xì)胞特異性CA方面取得了進(jìn)展，但由于缺乏敏感和特異性造影劑，其臨床實(shí)用性受到阻礙，部分原因是肝細(xì)胞特異性納米顆粒，無論其表面配體如何，都很容易被吞噬細(xì)胞吞噬。

基于此西北大學(xué)樊海明教授課題組在兔子，豬和獼猴中表明，肝膽MRI的性能可以通過由錳鐵氧體磁芯（直徑3nm）和聚（乙二醇）-乙氧基-芐基表面配體組成的超小納米顆粒與肝細(xì)胞特異性跨膜金屬和陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。與臨床使用的造影劑釓塞酸二鈉相比，納米顆粒促進(jìn)了更快，更靈敏和更高分辨率的肝膽MRI，大大提高了兔早期肝腫瘤的檢出率（92%對(duì)48%），并且更準(zhǔn)確地評(píng)估了獼猴的膽道梗阻。納米顆粒的性能和生物相容性支持肝臟特異性MRI造影劑的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化開發(fā)。相關(guān)成果以“A hepatocyte-targeting nanoparticle for enhanced hepatobiliary magnetic resonance imaging”為題發(fā)表在《Nature Biomedical Engineering》上，第一作者為張燁，Yingkun Guo和Ju Jiao。

圖1用于肝膽MRI的肝細(xì)胞特異性MnFe2O4-EOB-PEG納米顆粒CA的設(shè)計(jì)

MnFe2O4-EOB-PEG的合成與表征

通過動(dòng)態(tài)同步熱分解法制備了平均尺寸為3nm的超小MnFe2O4納米顆粒。然后，通過配體交換反應(yīng)，將準(zhǔn)備好的MnFe2O4納米顆粒與多巴胺-PEG-EOB分子共軛，得到了足以用于大型動(dòng)物研究的克級(jí)的MnFe2O4-EOB-PEG。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，MnFe2O4-EOB-PEG納米顆粒具有3nm的均勻尺寸（圖2a）。通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量，MnFe2O4-EOB-PEG納米顆粒的流體力學(xué)尺寸和多分散性分別為11.7nm和0.27（圖2b）。用3T核磁共振掃描儀來評(píng)估MnFe2O4-EOB-PEG的松弛性。MnFe2O4-EOB-PEG表現(xiàn)出8.01 mM-1 s-1的高r1弛豫性，小的r2/r1比率為2.76（圖2c）。此外，與大尺寸的納米顆粒相比，超小的MnFe2O4-EOB-PEG表現(xiàn)出明顯減少巨噬細(xì)胞的吞噬，證實(shí)了他們對(duì)單核巨噬細(xì)胞的逃避能力。

圖2 MnFe2O4-EOB-PEG和體外肝細(xì)胞親和力表征

體外肝細(xì)胞親和力表征

為了確定可能介導(dǎo)MnFe2O4-EOB-PEG和肝細(xì)胞之間相互作用的潛在受體，作者首先在LO2人類肝細(xì)胞系中進(jìn)行了共同免疫試驗(yàn)。如圖2d所示，觀察到SLC39A14和OATP1B1蛋白都與MnFe2O4-EOB-PEG有相互作用。相反，MnFe2O4-mPEG和γ-Fe2O3-EOB-PEG分別只與SLC39A14和OATP1B1蛋白相互作用。結(jié)果表明，EOB-PEG配體特異性地與OATP1B1結(jié)合，而SLC39A14是介導(dǎo)MnFe2O4納米顆粒與肝細(xì)胞結(jié)合的受體。進(jìn)一步用SLC39A14缺陷的肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SLC39A14表達(dá)下調(diào)后，MnFe2O4-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG的吸收量都明顯減少，而γ-Fe2O3-EOB-PEG的細(xì)胞內(nèi)量幾乎沒有變化（圖2e）。

超分辨率結(jié)構(gòu)照明顯微鏡圖像提供了納米粒子與受體結(jié)合親和力的進(jìn)一步證據(jù)（圖2f）。γ-Fe2O3-EOB-PEG處理組有明顯的γ-Fe2O3 EOB-PEG和OATP1B1熒光信號(hào)的共定位，而MnFe2O4-MPEG處理組顯示出強(qiáng)烈的MnFe2O4-mPEG和SLC39A14信號(hào)的共同定位。有趣的是，對(duì)于MnFe2O4-EOB-PEG處理組，不僅有MnFe2O4-EOB-PEG的熒光信號(hào)與OATP1B1或SLC39A14的共聚焦，而且還觀察到MnFe2O4-EOB-PEG信號(hào)與兩個(gè)受體的共聚焦。如圖2g所示，MnFe2O4-EOB-PEG的三色重疊系數(shù)急劇增加到~28.52%。這些結(jié)果表明，MnFe2O4-EOB-PEG與肝細(xì)胞的相互作用確實(shí)是由OATP1B1和SLC39A14共同介導(dǎo)的。

作者隨后通過納米顆粒與LO2人肝細(xì)胞共同培養(yǎng)來測(cè)量肝細(xì)胞的時(shí)間依賴性吸收。在所有指定的時(shí)間點(diǎn)，MnFe2O4-EOB-PEG的吸收量總是高于MnFe2O4-mPEG和γ-Fe2O3-EOB-PEG，表明MnFe2O4-EOB-PEG的肝細(xì)胞特異性吸收效率更高（圖2h）。進(jìn)一步采用表面等離子體共振（SPR）檢測(cè)來評(píng)估這些納米粒子與目標(biāo)細(xì)胞裂解液蛋白的肝細(xì)胞親和力。MnFe2O4-EOB-PEG的相對(duì)RU為378.5。比MnFe2O4-MPEG和γ-Fe2O3-EOB-PEG的大2.77和5.35倍（圖2i）。這表明MnFe2O4-EOB-PEG與肝細(xì)胞的結(jié)合親和力更強(qiáng)。

豬體內(nèi)肝細(xì)胞特異性MRI和安全性評(píng)估

為了測(cè)試MnFe2O4-EOB-PEG在體內(nèi)肝細(xì)胞特異性磁共振成像中的適用性，作者對(duì)豬的肝臟成像進(jìn)行了對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像。通過靜脈注射MnFe2O4-EOB-PEG給藥。γ Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG被設(shè)定為對(duì)照組。圖3a-c是在注射納米粒子后30分鐘采集的典型MR圖像。在注射MnFe2O4-EOB-PEG后，肝臟在T1加權(quán)MR圖像中高度增亮，可以明顯識(shí)別突出的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。相比之下，γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG在肝臟中的MR信號(hào)增強(qiáng)相對(duì)較低。為了確定體內(nèi)肝細(xì)胞的特異性，通過對(duì)切除的肝臟進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估來調(diào)查納米粒子在肝內(nèi)的分布。染色的肝臟組織（圖3a-c）顯示，大部分MnFe2O4-EOB-PEG分布在肝細(xì)胞中，而γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG出現(xiàn)在肝細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中。這些結(jié)果清楚地表明，MnFe2O4-EOB-PEG的體內(nèi)肝細(xì)胞特異性很高。肝臟的動(dòng)態(tài)對(duì)比度-噪聲比（CNR）（圖3d）表明，注射納米粒子后，肝臟CNR迅速增加，在注射后10分鐘達(dá)到最高水平，然后逐漸下降。接著作者進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布和排泄研究，以研究基于納米顆粒的CA在體內(nèi)的表現(xiàn)。圖3e顯示了濃度時(shí)間曲線。MnFe2O4-EOB-PEG的分布和消除半衰期縮短，這意味著MnFe2O4-EOB-PEG被肝細(xì)胞快速吸收并迅速被膽汁清除。值得注意的是，30分鐘時(shí)MnFe2O4-EOB-PEG的肝臟積累量比γ-Fe2O3-EOB-PEG和MnFe2O4-mPEG高3.26倍和2.97倍（圖3f）。

為了證實(shí)MnFe2O4-EOB-PEG的生物相容性，作者在豬身上進(jìn)一步評(píng)估了暴露于MnFe2O4-EOB-PEG后的血液學(xué)、組織學(xué)和神經(jīng)學(xué)影響，包括血清生化測(cè)試、常規(guī)血液學(xué)評(píng)估和血紅素和伊紅（H&E）染色切片的組織學(xué)檢查。在實(shí)驗(yàn)期間。在使用基于MnFe2O4-EOB-PEG的CA后，沒有一頭豬死亡，也沒有觀察到不良反應(yīng)。在血清生化測(cè)試中，測(cè)量了幾個(gè)重要的肝臟和腎臟功能參數(shù)（圖3g）。注射后評(píng)估的任何參數(shù)都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，表明肝臟和腎臟功能未受影響。

圖3：豬體內(nèi)肝細(xì)胞特異性磁共振成像和安全性評(píng)估

RI檢測(cè)兔的小HCCs

為了證明MnFe2O4-EOB-PEG的潛在診斷優(yōu)勢(shì)。作者比較了MnFe2O4-EOB-PEG和SLC39A14共同介導(dǎo)的肝細(xì)胞特異性對(duì)小型HCCs的檢測(cè)效果。隨機(jī)選擇一只兔子在MRI檢查后被殺死，對(duì)切除的肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。為了確保公平的比較，在腫瘤植入后的第7天，首先使用MnFe2O4-EOB-PEG對(duì)每只兔子進(jìn)行MRI檢查，48小時(shí)后，再次使用Gd-EOB-DTPA對(duì)兔子進(jìn)行檢查（圖4a）。在MRI檢查后，收集腫瘤，準(zhǔn)備進(jìn)行石蠟切片，并使用Pannoramic掃描儀進(jìn)行觀察。圖4b顯示了不同受體阻斷處理后的VX2腫瘤負(fù)擔(dān)兔的肝膽MR圖像。圖4c顯示了相應(yīng)的肝臟與腫瘤的CNR。對(duì)于對(duì)照組，兩種CAs的T1增強(qiáng)圖像顯示肝臟腫瘤為低密度，而正常組織為高密度，表明由于OATP和SLC39的低表達(dá)水平，肝細(xì)胞特異性藥劑很少被癌細(xì)胞吸收。圖4d顯示了一個(gè)2.35mm×2.60mm的肝臟腫瘤的典型肝膽MRI。由于MnFe2O4-EOB-PEG的高T1信號(hào)增強(qiáng)和高肝細(xì)胞特異性，使用MnFe2O4-EOB-PEG可以清楚地識(shí)別 "黑暗 "的腫瘤。事實(shí)上，MnFe2O4-EOB-PEG對(duì)非常小的肝臟腫瘤的檢測(cè)率高達(dá)92%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過Gd-EOB-DTPA（圖4e）。

圖4：兔子肝臟腫瘤的MR檢測(cè)

獼猴的肝膽道成像

由于肝細(xì)胞特異性藥劑的獨(dú)特的肝臟消除作用，在診斷肝膽道相關(guān)疾病方面，肝膽道MRI比使用細(xì)胞外CA的傳統(tǒng)動(dòng)態(tài)MRI提供了額外的功能。因此，作者比較了MnFe2O4-EOB-PEG和Gd-EOB-DTPA在獼猴身上的肝膽道成像性能。首先采集兩種CA的健康猴子的動(dòng)態(tài)MRI，盡管MnFe2O4-EOB-PEG的劑量比Gd-EOB-DTPA更低，但在肝膽期，MnFe2O4-EOB-PEG在肝實(shí)質(zhì)和膽管的信號(hào)增強(qiáng)更明顯（圖5a, b）。MnFe2O4-EOB-PEG的肝實(shí)質(zhì)和膽管的最大CNR比Gd-EOB-DTPA高6.72倍和10.53倍（圖5c，d）。更重要的是，使用MnFe2O4-EOB-PEG獲得了肝膽道的高分辨率MR圖像，據(jù)此可以清楚地描繪出直徑小至0.5毫米的肝管。在注射MnFe2O4-EOB-PEG后，膽管的CNR迅速增加，并在20分鐘達(dá)到最大值（圖5d）。鑒于這一結(jié)果，作者進(jìn)一步評(píng)估了MnFe2O4-EOB-PEG在肝膽道成像中診斷膽道相關(guān)疾病的潛力。為此，作者在開腹手術(shù)后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，通過部分結(jié)扎總膽管建立了膽道梗阻猴模型。MR胰膽管造影（MRCP）顯示肝外膽管明顯不連續(xù)，表明在獼猴中建立了膽道梗阻模型（如圖5e所示）。

圖5 獼猴的肝膽道成像

小結(jié)：作者開發(fā)了一種敏感的、具有生物相容性的MnFe2O4-EOB-PEG納米粒子，具有優(yōu)越的肝細(xì)胞特異性，可用于大型動(dòng)物模型的高效肝膽MRI。作者的研究表明，MnFe2O4-EOB-PEG與臨床上使用的Gd-EOB-DTPA相比，在小肝臟腫瘤和其他病變的無創(chuàng)磁共振診斷方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。再加上良好的生物相容性，MnFe2O4-EOB PEG作為新一代肝臟特異性磁共振成像CA具有很好的臨床潛力。

來源：高分子科學(xué)前沿