近期，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員王艷麗課題組和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)教授龔為民課題組合作，在Nature Communications上，在線發(fā)表題為Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2的研究論文，報(bào)道Cas12i2-crRNA和Cas12i2-crRNA-DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示Cas12i2對(duì)DNA的識(shí)別和切割機(jī)制，首次觀察到CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的RuvC催化結(jié)構(gòu)域活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。該研究揭示Cas12i2降解DNA的分子機(jī)理，有利于理解含有RuvC結(jié)構(gòu)域的Cas蛋白的催化機(jī)制。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，其中，Cas9和Cas12a是目前常用的基因編輯工具，RuvC結(jié)構(gòu)域是Cas9與Cas12切割DNA的重要催化部位。因此，獲得RuvC結(jié)構(gòu)域，并結(jié)合底物DNA和金屬離子的結(jié)構(gòu)，對(duì)了解RuvC 結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制有重要意義。

此前，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)V-I亞型效應(yīng)蛋白Cas12i，Cas12i比目前用于基因編輯工具的Cas12a和Cas9分子量更小，有望成為新的基因編輯工具。據(jù)此可知，研究Cas12i的結(jié)構(gòu)和功能有重要意義。該研究報(bào)道Cas12i2的crRNA結(jié)合狀態(tài)、種子區(qū)域配對(duì)狀態(tài)、催化狀態(tài)三種不同狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)crRNA：DNA配對(duì)長(zhǎng)度大于13 nt時(shí)，Cas12i2的Helical-II結(jié)構(gòu)域才會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致底物結(jié)合通道打開，激活RuvC結(jié)構(gòu)域；在高分辨率Cas12i2-crRNA-DNA三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，RuvC結(jié)構(gòu)域同時(shí)結(jié)合一段底物ssDNA和2個(gè)鎂離子，揭示RuvC結(jié)構(gòu)域雙鎂離子依賴的DNA切割機(jī)制，這是首次觀察到RuvC結(jié)構(gòu)域同時(shí)結(jié)合底物DNA和金屬離子，展示其活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。

此外，研究人員還研究Cas12i2的生化性質(zhì)，揭示Cas12i2前體crRNA加工機(jī)制，發(fā)現(xiàn)前體crRNA的加工影響雙鏈DNA切割活性。研究表明，Cas12i2具有PAM非依賴型的非特異性單鏈DNA的切割活性；種子區(qū)域的完美配對(duì)對(duì)于雙鏈DNA的切割有重要意義，卻不是單鏈DNA切割的必要條件。該研究對(duì)于基因編輯和核酸檢測(cè)工具的開發(fā)具有重要意義。

中國(guó)科大博士生黃雪為論文第一作者，王艷麗、生物物理所高級(jí)工程師盛剛和龔為民為論文的共同通訊作者。研究工作得到科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金及中科院的資助，并得到上海同步輻射光源（SSRF）及日本同步輻射光源（SPring-8）的技術(shù)支持。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-19072-6

Cas12i2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。A.Cas12i2-crRNA-DNA三元復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)；B.Cas12i2的RuvC結(jié)構(gòu)域催化中心