顆粒在線訊：三維(3D)生物打印為制造復雜的載有細胞的組織結構提供了一條新路徑。然而，由于大多數(shù)生物打印過程的內在復雜性，以及缺乏長期儲存載有細胞的組織結構的功能性方法，現(xiàn)有的生物打印的一個重大缺點是打印的細胞組織只能立刻使用難以保存。結合制造和儲存方法（即生物打印和冷凍保存）是解決上述障礙的潛在解決方案。而這種方法應該解決的主要挑戰(zhàn)是冰晶的形成和重結晶，這可能會對制造的產(chǎn)品中的細胞活力產(chǎn)生負面影響。冷凍保護劑(CPA)被認為對消除或最小化冰晶形成具有關鍵作用。二甲基亞砜(DMSO)是一種傳統(tǒng)的CPA，具有較大分子量的CPA（如糖類）可以保護細胞免受凍融期間細胞外高滲和低滲條件引起的滲透損傷。

哈佛大學醫(yī)學院Yu Shrike Zhang教授團隊報道了一種低溫生物打印策略，通過無縫結合擠壓生物打印和低溫保存，可以同時制造和存儲充滿細胞的組織結構。在冷凍板精確控制溫度條件下，使用不同類型和濃度的CPA設計了基于甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)的生物墨水組合物，并使用擠壓式生物打印機制造出充滿細胞的不同形狀的組織結構。原位冷凍過程進一步提高了細胞負載水凝膠生物墨水的打印性能，并且能夠制造各種所需形狀的結構。細胞分化和血管生成數(shù)據(jù)顯示，冷凍生物打印的細胞在復蘇后仍然具有活力和功能。該策略可廣泛用于組織工程、再生醫(yī)學、組織模型工程和藥物篩選的應用，為臨床前和臨床環(huán)境中的組織替換等研究鋪平道路。此研究以題為“Freeform cell-laden cryobioprinting for shelf-ready tissue fabrication and storage”發(fā)表在最新一期的《Matter》上。

圖1：用于同時低溫保存的生物打印示意圖

【冷凍打印和傳熱模擬】

該方法的關鍵點是載有細胞的水凝膠前體在一個定制的可精確控制溫度的冷凍板上進行生物打印組織構建。從生物打印機噴嘴擠出并與冷凍板接觸后，生物墨水原位迅速凝固并形成穩(wěn)定的結構，以便短期和長期儲存。低溫保存條件下取出后，首先紫外交聯(lián)，然后在預加熱37℃的PBS中快速解凍，避免冰晶形成的同時去除殘留的CPA。使用5% (w/v)的GelMA或明膠作為基礎生物墨水來創(chuàng)建自由形狀的結構，其中一些結構可以通過傳統(tǒng)的直接擠壓生物打印方法進行復雜化。在COMSOL軟件中對網(wǎng)格結構的逐層低溫生物打印進行建模，以了解該過程中的熱傳遞機制。冷凍生物墨水的邊界與模擬模型的邊界完美匹配，表明模擬與實驗之間具有良好的一致性。

圖2：樣品低溫生物打印構建和模擬結果

【基于細胞活力測定的低溫保護生物墨水設計】

研究了生物墨水成分（GelMA、DMSO和列出的六種糖類之一）對各種細胞的冷凍保存和復蘇的影響。在不含DMSO的對照樣品中，高度針狀的冰晶快速形成。增加DMSO濃度，冰晶的平均尺寸顯著減小。當糖濃度增加時，沒有觀察到結晶的顯著改善，但無論DMSO濃度如何，無糖組的細胞存活率普遍較低。糖的存在避免了解凍過程中的滲透休克，是低溫保護生物墨水的重要組成部分。將各組細胞活力按相同DMSO濃度歸一化至對照組，選擇功能最豐富的糖及其最適濃度。結果顯示提高細胞存活率的最有效糖類為12% (w/v)的肉豆蔻糖、4% (w/v)的棉子糖和4% (w/v)的乳糖，DMSO的濃度為10% (v/v)。使用三個選擇的生物墨水組合來評估方法的可行性，結果顯示冷凍保存72h后，所有細胞類型的存活率均明顯高于未添加CPA的對照組。

表1：所用的糖類及其性質

圖3：不同墨水低溫保存后的細胞活力

【冷凍生物打印對細胞影響】

冷凍生物打印過程中的樣品冷凍率對冰晶形成和細胞活力具有重要影響。實驗結果說明細胞活力不受與冷凍板距離的顯著影響，支架不同層內的平均細胞活力均在85%左右，在可接受的范圍內。冷凍生物打印的載有人類間充質干細胞（hMSC）的樣品冷凍保存14天和28天后，未觀察到液氮中冷凍保存的樣品的細胞存活率之間存在顯著差異。

使用hMSCs通過冷凍生物打印后的細胞分化測定來研究它們的功能。冷凍生物打印的載有hMSCs的樣品在液氮中冷凍保存14天后，將樣品交聯(lián)、復蘇并培養(yǎng)1周，然后再加入分化培養(yǎng)基。研究了成骨、成軟骨和成脂三種類型的細胞分化，結果顯示冷凍生物打印樣品不會對hMSC的功能產(chǎn)生負面影響。

絨毛膜（CAM）測定用于評估冷凍生物打印支架的血管生成潛力。同樣地，液氮中冷凍保存14天后，構建的打印物被植入到第7天的卵泡CAM中，并在7天的孵育后被收集。使用圖像處理方法和組織學確定冷凍生物打印組織中血管生成的程度，測量新形成的血管的平均長度以量化圍繞不同冷凍生物打印結構的血管生成反應。結果顯示，冷凍生物打印程序不會影響血管內皮細胞和內皮生長因子的功能。

圖4：低溫生物打印的細胞活力和細胞分化實驗

【小結】

綜上所述，該工作報告并優(yōu)化了一種冷凍生物打印方法，可同時制備和存儲載有細胞的組織結構。載有細胞的組織結構可以長期儲存并在交聯(lián)、解凍和復蘇后使用，不會影響其正常功能。隨著組織工程領域的快速發(fā)展，這些可存儲的植入物有望促進生物打印方法的臨床轉化。