顆粒在線訊：近日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究中心研究員儲(chǔ)軍課題組在《自然-通訊》（Nature Communications）上，發(fā)表了題為A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging的研究論文，報(bào)道了高性能基因編碼的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）熒光探針及其應(yīng)用。

　　cAMP是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵第二信使，可整合來自多種G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的信號，在學(xué)習(xí)與記憶、藥物成癮、運(yùn)動(dòng)控制、免疫、腫瘤、代謝等過程中發(fā)揮重要作用?；罴?xì)胞和活體水平的cAMP分子濃度變化的高時(shí)空分辨率熒光成像是解析cAMP信號通路及其生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)。因此，開發(fā)高靈敏的cAMP熒光探針成為研究復(fù)雜生物過程的關(guān)鍵。與非基因編碼探針（染料和材料類）相比，基因編碼探針具有低毒性、低背景、可遺傳、可定位特定細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)或特定細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中具有優(yōu)勢。然而，現(xiàn)有的50多個(gè)基因編碼的cAMP熒光探針或靈敏度低（熒光變化最大只有1.5倍），或熒光亮度較暗，較難監(jiān)測活體中微弱的內(nèi)源性cAMP變化，限制了生理和病理狀態(tài)下cAMP分子調(diào)控機(jī)理和功能的研究。

　　為了開發(fā)適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環(huán)化重排綠色熒光蛋白（cpGFP）插入細(xì)菌MlotiK1通道的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（mlCNBD）中。經(jīng)過插入位點(diǎn)篩選、連接肽優(yōu)化、熒光蛋白及感應(yīng)模塊優(yōu)化，研究得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應(yīng)速度等特征的高性能基因編碼cAMP綠色熒光探針（G-Flamp1）。晶體結(jié)構(gòu)顯示G-Flamp1探針的連接肽具有獨(dú)一無二的結(jié)構(gòu)：其中一個(gè)連接肽是一個(gè)非常剛性的 β-strand 結(jié)構(gòu)，這在其他晶體結(jié)構(gòu)已知的環(huán)化重排熒光蛋白探針中是不存在的，為開發(fā)其他高性能探針提供了新思路和新方法。

　　在體外實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合/未結(jié)合cAMP的G-Flamp1有不同發(fā)色團(tuán)環(huán)境。G-Flamp1在450 nm（單光子）或者900-920 nm（雙光子）激發(fā)下，動(dòng)態(tài)范圍達(dá)最大，即ΔF/F0約為13。G-Flamp1與cAMP親和力適中，其解離常數(shù)Kd值為2.17 μM。G-Flamp1可在亞秒時(shí)間分辨率上檢測cAMP動(dòng)態(tài)變化。在培養(yǎng)細(xì)胞中，該探針均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，本底熒光亮度介于同類探針cAMPr和Flamindo2之間。G-Flamp1探針在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到了12倍，是目前少數(shù)幾個(gè)動(dòng)態(tài)范圍在10倍以上的熒光蛋白探針之一。同時(shí)，該探針具有良好的特異性和可逆性（圖1）。

　　研究人員將G-Flamp1探針應(yīng)用在果蠅這一模式生物中。果蠅腦部蘑菇體（mushroom body）的Kenyon細(xì)胞中cAMP信號通路在氣味相關(guān)的記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究首先獲取了Kenyon細(xì)胞中表達(dá)G-Flamp1探針的轉(zhuǎn)基因果蠅，而后利用雙光子成像發(fā)現(xiàn)，果蠅受到氣味或電擊刺激時(shí)，蘑菇體不同子區(qū)域呈現(xiàn)不一樣的cAMP信號時(shí)空變化（圖2），暗示不同子區(qū)域可能在聯(lián)想性學(xué)習(xí)中起著相對獨(dú)立的作用。

　　為驗(yàn)證G-Flamp1探針在活體動(dòng)物中檢測cAMP 動(dòng)態(tài)變化的實(shí)用性，研究人員利用腺相關(guān)病毒在小鼠運(yùn)動(dòng)皮層中共表達(dá)綠色G-Flamp1探針和紅色jRGECO1a鈣探針?；铙w雙光子成像揭示了跑步運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞特異性的cAMP信號，并與鈣信號無明顯相關(guān)性（圖3)。這反映了小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)大腦皮層M1神經(jīng)元反應(yīng)的異質(zhì)性。

　　研究人員在小鼠大腦深部的伏隔核（NAc）腦區(qū)中表達(dá)G-Flamp1探針，并利用光纖記錄聽覺巴甫洛夫條件反射任務(wù)中該腦區(qū)cAMP信號的變化。結(jié)果表明隨著訓(xùn)練的熟練，小鼠得到獎(jiǎng)賞時(shí)cAMP信號幅度在降低，而聽到相應(yīng)聲頻信號時(shí)cAMP信號幅度在升高（圖4）；該特性與多巴胺信號類似，暗示多巴胺釋放引起了cAMP信號。綜上，G-Flamp1探針的高信噪比和高時(shí)間分辨率能夠高靈敏檢測到活體小鼠中內(nèi)源性cAMP信號的動(dòng)態(tài)變化。

　　該研究開發(fā)了一種適用于活體檢測的cAMP熒光探針，并初步揭示了果蠅和小鼠等模式生物在特定行為過程中特定神經(jīng)元的cAMP信號變化的規(guī)律，為進(jìn)一步闡釋cAMP信號的調(diào)控和功能奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合高內(nèi)涵藥物篩選平臺(tái)，該探針將嘗試應(yīng)用于針對GPCR受體的藥物篩選，以期發(fā)現(xiàn)更多的具有臨床價(jià)值的GPCR藥物。  

　　研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助，并獲得北京大學(xué)、中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院、美國堪薩斯州立大學(xué)、華中科技大學(xué)等的支持。

圖1.G-Flamp1探針在體外和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的表征

圖2.不同刺激下果蠅Kenyon細(xì)胞中cAMP信號的變化

圖3.運(yùn)動(dòng)過程中小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)cAMP信號的變化

圖4.巴甫洛夫條件反射任務(wù)中小鼠NAc腦區(qū)cAMP信號的變化