顆粒在線訊：聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料具有成本低、便攜、穩(wěn)定、氣密性好、透明度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于紡織行業(yè)、家用電器及食品包裝等領(lǐng)域，但在自然界中難以解聚，造成了比較嚴重的環(huán)境污染。目前，廢棄塑料的有效回收與再利用已成為全球性的研究熱點。PET的酶促解聚為廢棄塑料的回收利用提供了綠色途徑。IsPETase是近年來報道在常溫下對PET水解活性最高的酶，但穩(wěn)定性較差，引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注?；贗sPETase晶體結(jié)構(gòu)的（半）理性改造已獲得一系列催化性能提升的突變體。定向進化是提高IsPETase催化性能的有效方法之一，可以挖掘出遠離活性位點的潛在有益突變位點，但IsPETase缺乏高效靈敏的高通量篩選方法。 

　　針對上述PET水解酶定向進化缺乏高通量篩選方法的技術(shù)瓶頸，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員朱蕾蕾帶領(lǐng)的蛋白質(zhì)定向進化研究團隊與南京中醫(yī)藥大學(xué)教授劉海峰合作，首次發(fā)展了以PET結(jié)構(gòu)類似物為底物，基于熒光檢測的PETase水解活性微孔板篩選方法?？蒲腥藛T巧妙地設(shè)計了一種新型化合物BHET-OH（PET寡聚物BHET的衍生物）。該化合物被PETase水解后可以生成帶有熒光信號的產(chǎn)物TPA-OH，對反應(yīng)體系的連續(xù)熒光檢測可以快速測定PETase的水解活性。該熒光法適用于其他PET水解酶。研究基于建立的篩選方法，對PETase進行多輪定向進化，進而Tm值提高了23.3°C，收獲了對無定型PET膜的水解活力大幅提高的最佳突變體DepoPETase。DepoPETase在中溫下實現(xiàn)了多種PET廢棄包裝的完全解聚，同時其水解活性與穩(wěn)定性通過了3L發(fā)酵罐中19.1 g PET廢棄包裝完全解聚的升級放大實驗的驗證。研究通過分子動力學(xué)模擬闡釋了該酶的催化性能提升的機理，發(fā)現(xiàn)DepoPETase的有益突變主要是通過疏水作用、鹽橋、氫鍵等相互作用，增強催化三聯(lián)體附近的6個loop的網(wǎng)絡(luò)相互作用，進而將穩(wěn)定效應(yīng)傳遞到活性中心，從而提高該酶的催化性能。該工作通過定向進化技術(shù)和新穎的高通量篩選方法提高了IsPETase的PET水解活性和熱穩(wěn)定性，為PET水解酶的分子改造提供了新思路和新方法，并為PET的酶降解循環(huán)利用提供了高效的酶催化劑。 

　　近日，相關(guān)研究成果發(fā)表在《德國應(yīng)用化學(xué)》上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動、中科院STS項目的支持。 

基于熒光篩選方法的PET的定向進化研究成果

來源：天津工業(yè)生物技術(shù)研究所